近兩年來(lái)，基因療法領(lǐng)域取得了重大突破，2017年底，明星基因療法公司Spark Therapeutics開發(fā)的Luxturna獲得FDA批準(zhǔn)上市，成為首款在美國(guó)獲批的“體內(nèi)給藥型”基因療法。而諾華公司開發(fā)的Zolgensma也有望在本月獲得FDA批準(zhǔn)，成為第二款“體內(nèi)給藥型”基因療法。根據(jù)再生醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（ARM）發(fā)布的報(bào)告，截至到2019年第一季度末，全球有371項(xiàng)基因療法處于臨床開發(fā)階段，與2018年同期相比，增長(zhǎng)了17%。

        作為遞送基因療法的有力工具，腺相關(guān)病毒（AAV）的開發(fā)和制造也成為業(yè)界的關(guān)注焦點(diǎn)之一。近日多家公司通過(guò)合作和并購(gòu)，擴(kuò)展AAV的設(shè)計(jì)和制造能力。日前，Nature Reviews Drug Discovery上發(fā)表一篇綜述，通訊作者是馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院（University of Massachusetts）的基因療法專家高光坪教授。這篇綜述對(duì)這一基因療法遞送平臺(tái)進(jìn)行了詳細(xì)介紹，今天藥明康德的微信團(tuán)隊(duì)將與讀者分享這篇文章的精彩內(nèi)容。

        腺相關(guān)病毒基本構(gòu)造和作為基因療法載體的運(yùn)作機(jī)理

        腺相關(guān)病毒是一種單鏈DNA病毒，目前的科學(xué)界共識(shí)是它不會(huì)導(dǎo)致任何人類疾病。它由蛋白衣殼（capside）和長(zhǎng)度為4.7kb的單鏈DNA基因組構(gòu)成。蛋白衣殼由三個(gè)亞基組成，分別為VP1，VP2，和VP3。AAV基因組兩端為兩個(gè)“T”型的末端反向重復(fù)序列（inverted terminal repeat, ITR）。這兩個(gè)ITRs是病毒DNA復(fù)制的起點(diǎn)和觸發(fā)病毒包裝的信號(hào)。AAV基因組中的rep基因編碼4個(gè)與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白，分別為Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40。

        作為基因療法載體的重組腺相關(guān)病毒（rAAV）攜帶的蛋白衣殼與野生型AAV幾乎完全相同，然而衣殼內(nèi)的基因組中編碼病毒蛋白的部分完全被刪除，取而代之的是治療性轉(zhuǎn)基因（transgene）。AAV基因組中唯一被保留的部分是ITRs，它起到指導(dǎo)基因組的復(fù)制和病毒載體組裝的作用。將編碼病毒蛋白的部分完全刪除的優(yōu)點(diǎn)是：一方面可以化重組AAV攜帶轉(zhuǎn)基因的容量，另一方面減小體內(nèi)遞送轉(zhuǎn)基因時(shí)產(chǎn)生的免疫原性和細(xì)胞**。

        重組AAV顆粒通過(guò)與宿主細(xì)胞表面表達(dá)的糖化受體相結(jié)合，通過(guò)網(wǎng)格蛋白（clathrin）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)吞形成的內(nèi)體（endosome）酸化之后，病毒衣殼的VP1/VP2部分構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致病毒從內(nèi)體中脫離，并且通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核后，單鏈DNA從衣殼中釋放出來(lái)。這時(shí)單鏈DNA還不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，它們需要變成雙鏈DNA。單鏈DNA可以利用宿主細(xì)胞的DNA聚合酶來(lái)合成互補(bǔ)鏈，或者兩條從不同AAV顆粒中釋放的互補(bǔ)鏈退火（annealing）形成雙鏈DNA。

        最新的AAV基因組設(shè)計(jì)能夠?qū)⒁職ぶ袛y帶的單鏈DNA設(shè)計(jì)成自我互補(bǔ)（self-complementary）的序列。這種序列的優(yōu)點(diǎn)在于它不需要單鏈DNA復(fù)制成為雙鏈DNA的步驟就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，與傳統(tǒng)的單鏈AAV基因組相比，它的基因表達(dá)更為迅速，而且表達(dá)量更高。諾華公司開發(fā)的治療脊髓性肌肉萎縮癥（SMA）的Zolgensma就使用了這種基因組設(shè)計(jì)。然而這種設(shè)計(jì)的一個(gè)缺點(diǎn)是AAV攜帶的轉(zhuǎn)基因容量減半。

        雙鏈形式的AAV基因組然后利用ITRs進(jìn)行分子內(nèi)或分子間基因組重組，這一過(guò)程讓AAV基因組成為穩(wěn)定的游離DNA（episomal DNA），導(dǎo)致基因組能夠在不再進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞中持續(xù)進(jìn)行基因表達(dá)。

        AAV載體的轉(zhuǎn)化應(yīng)用

        截至2018年11月13日，在ClinicalTrials.gov上有145項(xiàng)干預(yù)性臨床試驗(yàn)中使用重組AAV載體。目前，兩款重組AAV載體已經(jīng)獲得批準(zhǔn)在患者身上使用，它們是uniQure公司開發(fā)的Glybera（AAV1）和Spark Therapeutics公司開發(fā)的Luxturna（AAV2）。而諾華公司開發(fā)的Zolgensma（AAV9）可能在本月加入獲批療法的行列。

        目前，大約有10來(lái)種不同血清型的AAV在臨床試驗(yàn)中作為基因療法的載體，基于AAV2的基因遞送平臺(tái)雖然仍然是最多的，但是諸如AAV8，AAV9和AAVrh.10等新一代衣殼正在臨床試驗(yàn)中得到更多應(yīng)用。下面我們來(lái)看一看這些臨床試驗(yàn)的特征。

        重組AAV載體遞送基因的靶向組織

        大部分基因療法研發(fā)項(xiàng)目的靶向組織是肝 臟、橫紋肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。幾乎所有天然AAV衣殼蛋白能夠在肝 臟中引發(fā)有效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，因此靶向肝 臟的重組AAV為治療一系列疾病提供了優(yōu)良的基因遞送平臺(tái)。它們包括A型和B型血友病、家族性高膽固醇血癥等疾病。

        AAV8和AAV9衣殼蛋白能夠靶向身體中的多種肌肉類型，這讓AAV介導(dǎo)的基因療法能夠用于治療多種肌肉疾病，其中包括杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）。值得一提的是，肌肉可以作為生成治療性分子的“體內(nèi)工廠”，因此靶向肌肉組織的基因療法可以用于治療非肌肉疾病。

        重組AAV遞送的基因療法的另一個(gè)重要方向是CNS，包括眼睛和大腦。眼睛是一個(gè)相對(duì)隔離的環(huán)境，直接進(jìn)行眼內(nèi)注射遞送AAV基因療法能夠達(dá)到治療多種遺傳性眼病的效果。Spark Therapeutics公司開發(fā)的獲批療法Luxturna就是治療由于RPE65基因突變而導(dǎo)致失明的患者。

        而靜脈輸入的AAV9和AAVrh.10能夠穿越血腦屏障，在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中引發(fā)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)帶來(lái)多項(xiàng)針對(duì)CNS疾病的研究，其中包括SMA，肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS），GM1神經(jīng)節(jié)苷脂病，和粘多糖貯積癥III型等等。

        AAV基因療法策略

        基因替代：這一策略的目標(biāo)是遞送表達(dá)正常蛋白的基因來(lái)彌補(bǔ)功能喪失性突變的影響。它適用于治療隱性單基因疾病，已經(jīng)臨床試驗(yàn)中獲得極大成功。Glybera和Luxturna就是很好的例子。Glybera基于重組AAV1平臺(tái)遞送表達(dá)編碼脂蛋白脂肪酶（LPL）的轉(zhuǎn)基因，它用于治療LPL缺失患者。而Luxturna則使用AAV2平臺(tái)來(lái)遞送正常RPE65基因。這兩款療法都使用局部注射的施藥方法，分別注射到患者的肌肉和眼睛中。

        新一代AAV血清型的發(fā)現(xiàn)讓研究人員可以通過(guò)靜脈注射AAV載體將轉(zhuǎn)基因遞送到全身。這些新的AAV載體為治療A型和B型血友?。ò邢蚋?臟），DMD（靶向全身肌肉）和SMA（廣發(fā)靶向CNS，包括脊髓）帶來(lái)了有效療法。本月有望獲批的Zolgensma就是一個(gè)范例，這是一款利用AAV9載體遞送編碼運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白（SMN）的SMA轉(zhuǎn)基因的基因療法。在很多疾病中，只需在部分細(xì)胞中表達(dá)正?；蚓妥阋跃徑饧膊〉陌Y狀。

        基因沉默：與基因替代相反，基因沉默的目標(biāo)是治療由于功能獲得性基因突變導(dǎo)致的單基因疾病，例如亨廷頓?。℉untington disease）。RNAi療法目前是AAV基因沉默平臺(tái)的首選策略。然而，與合成RNAi療法的飛速進(jìn)展相比，基于AAV遞送平臺(tái)的RNAi療法目前仍處于臨床前開發(fā)階段。基因沉默需要在大部分組織中發(fā)生才能夠起到有意義的治療效果，在某些器官中（例如大腦），這對(duì)于AAV載體來(lái)說(shuō)還是一個(gè)挑戰(zhàn)。

        在RNAi策略以外，使用CRISPR-Cas系統(tǒng)來(lái)靶向RNA也是一種基因靜默的策略。不過(guò)這一策略需要克服的障礙是重組AAV容納的轉(zhuǎn)基因大小有限，而且從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的Cas蛋白可能引發(fā)免疫反應(yīng)，從而降低療效。

        遞送新基因：除了治療單基因疾病以外，AAV介導(dǎo)的基因療法具有通過(guò)遞送新基因來(lái)治療復(fù)雜遺傳病或者傳染病的潛力。例如，心力衰竭和傳染病代表著具有高度未經(jīng)需求的疾病領(lǐng)域，通過(guò)引入新基因，基因療法可以提供生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)與心力衰竭相關(guān)的信號(hào)通路，以及表達(dá)中和致命病毒感染的抗體。目前的臨床試驗(yàn)正在檢驗(yàn)，使用肌肉作為生成治療性抗體的“生物工廠”，治療HIV感染的治療方法。

        改進(jìn)AAV載體的手段

        當(dāng)重組AAV在20多年前第一次表現(xiàn)出作為基因療法載體的臨床活性之后，研究人員就在不斷對(duì)衣殼蛋白進(jìn)行改造，試圖賦予它新的功能和特征。隨著科技的進(jìn)步，開發(fā)新衣殼蛋白的策略也不斷演變。

        目前，衣殼蛋白開發(fā)的策略可以分為3大類：天然發(fā)現(xiàn)，理性設(shè)計(jì)，和定向進(jìn)化。隨著近年來(lái)計(jì)算能力和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)模型的進(jìn)展，一個(gè)新的衣殼蛋白設(shè)計(jì)分支出現(xiàn)了。這就是計(jì)算機(jī)發(fā)現(xiàn)（in silico discovery）策略。下面我們來(lái)看一看這些不同策略的優(yōu)缺點(diǎn)。

        天然發(fā)現(xiàn)

        目前有臨床應(yīng)用潛力的AAV血清型都是從天然來(lái)源中分離出來(lái)的。其中的范例就是AAV9，它是從人類肝組織中分離出來(lái)的。AAV9具有穿越血腦屏障的能力，這讓它成為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中遞送基因療法的首選衣殼。除了能夠感染CNS的AAV血清型以外，天然人類和非人靈長(zhǎng)類（NHP）AAV感染的主要器官為肝 臟和脾 臟。

        然而，使用人類AAV衣殼的一個(gè)缺陷是大部分人由于在一生中受到過(guò)AAV的感染，導(dǎo)致他們體內(nèi)攜帶針對(duì)AAV衣殼的抗體。據(jù)傳染病學(xué)統(tǒng)計(jì)，40-80%的人體內(nèi)攜帶針對(duì)AAV的抗體。這可能導(dǎo)致AAV作為基因療法載體在未遞送轉(zhuǎn)基因時(shí)就被免疫系統(tǒng)摧毀，降低轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。

        解決這一難題的策略包括使用從非人靈長(zhǎng)類中分離的AAV衣殼，以及其它脊椎動(dòng)物中分離的AAV衣殼蛋白。目前，從非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和豬身上獲取的AAV衣殼種類在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)基因遞送能力。

        理性設(shè)計(jì)

        理性設(shè)計(jì)是改良病毒載體衣殼的首選策略之一。最初的改良策略包括將特定多肽序列嫁接在衣殼表面，讓它們可以與特定細(xì)胞表面的受體相結(jié)合。這可以讓病毒載體感染原先無(wú)法被感染的細(xì)胞。

        另一個(gè)改良病毒載體衣殼的方向是擾亂細(xì)胞對(duì)衣殼蛋白的降解過(guò)程。已有研究表明，通過(guò)點(diǎn)突變改變衣殼表面酪氨酸可以在小鼠模型中將轉(zhuǎn)基因在肝細(xì)胞中的表達(dá)水平提高30倍。這一改變不但抑制了蛋白酶體對(duì)AAV衣殼的降解，而且改善了病毒載體在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。

        定向進(jìn)化

        由于我們對(duì)AAV與細(xì)胞表面受體結(jié)合，內(nèi)化，在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，以及進(jìn)行基因表達(dá)的生理過(guò)程還不夠了解，這方面知識(shí)的缺陷限制了理性設(shè)計(jì)的應(yīng)用。因此，定向進(jìn)化手段在很多情況下成為優(yōu)化病毒載體更有效的策略。

        定向進(jìn)化的原則是模擬自然進(jìn)化的機(jī)制，在衣殼蛋白中引入大量隨機(jī)突變，然后在選擇壓力下篩選出具有特定生物性質(zhì)和特征的衣殼。例如，它們可能可以靶向特定組織，或者逃避免疫監(jiān)控，或者提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。這一策略的優(yōu)點(diǎn)在于我們不需要對(duì)相應(yīng)的分子機(jī)制有深入的了解。

        目前，通過(guò)容易出錯(cuò)的PCR可以在編碼衣殼蛋白的基因中引入大量隨機(jī)突變，從而建立一個(gè)具有豐富多樣性的衣殼蛋白庫(kù)。另一種建立多樣性衣殼蛋白庫(kù)的方法是將不同種類的天然衣殼蛋白中的不同部分隨機(jī)組合起來(lái)構(gòu)成嵌合衣殼蛋白。

        隨著下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）的進(jìn)步，定向進(jìn)化手段成為更為強(qiáng)大的發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新病毒載體衣殼的方法?；贜GS開發(fā)的篩選技術(shù)如今可以每次對(duì)上千種攜帶不同衣殼的病毒載體進(jìn)行篩選，從而迅速迭代，發(fā)現(xiàn)能夠在特定細(xì)胞或組織中導(dǎo)致基因表達(dá)的衣殼蛋白。

        In silico生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)策略

        生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)工具可以通過(guò)比較不同AAV的衣殼蛋白序列，推斷出衣殼蛋白的進(jìn)化過(guò)程，并且發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白上具備高度多樣性的區(qū)域。這可以幫助在這些區(qū)域引入變異，與定向進(jìn)化手段相結(jié)合，更有效地篩選出新型病毒衣殼蛋白。

        結(jié)語(yǔ)

        基因療法是獲得業(yè)界關(guān)注的創(chuàng)新治療平臺(tái)。而作為遞送轉(zhuǎn)基因的有力手段，AAV載體平臺(tái)的研發(fā)也在出現(xiàn)指數(shù)型增長(zhǎng)。雖然對(duì)AAV的研究屬于病毒學(xué)領(lǐng)域，但是將AAV轉(zhuǎn)化為基因療法載體的過(guò)程需要多學(xué)科的聯(lián)合研究。分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、傳染病學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、免疫學(xué)、和基因組學(xué)等方面的突破對(duì)AAV載體平臺(tái)的成功開發(fā)都起到不可或缺的作用。

        AAV載體平臺(tái)的發(fā)展仍然需要克服多項(xiàng)挑戰(zhàn)，其中包括如何經(jīng)濟(jì)有效地生成足夠數(shù)量的治療性AAV載體，以及克服人體免疫系統(tǒng)對(duì)AAV載體和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫排斥作用。克服這些挑戰(zhàn)對(duì)推廣AAV介導(dǎo)的基因療法具有關(guān)鍵性的意義。

        我們期待隨著AAV研發(fā)領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展和多學(xué)科手段的應(yīng)用，我們能夠克服目前遇到的挑戰(zhàn)，實(shí)現(xiàn)AAV基因療法的全部潛力。

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