2012 年，CRISPR-Cas9的發(fā)現(xiàn)開啟了基因編輯新時代，此后的十多年里，基于CRISPR的基因編輯技術(shù)得到了快速發(fā)展，并被成功應(yīng)用放到了人體臨床試驗中已治療遺傳疾病和癌癥。與此同時，全世界的科學(xué)家們也在不斷挖掘新的具有基因編輯潛力的新工具，以解決Cas9 蛋白體積過大（約1400個氨基酸），難以通過 AAV 病毒載體進(jìn)行遞送以進(jìn)行體內(nèi)基因編輯的難題。
該研究通過對 CRISPR-Cas9 的祖先IscB進(jìn)行進(jìn)化改造，成功創(chuàng)造出僅有 Cas9 一半大小的NovalscB系統(tǒng)（僅 614 個氨基酸），基因編輯效率提升百倍，研究團(tuán)隊將NovalscB系統(tǒng)與甲基轉(zhuǎn)移酶融合，進(jìn)而創(chuàng)建一個可編程的表觀遺傳編輯系統(tǒng)——OMEGAoff，其緊湊程度足以被裝載到單個腺相關(guān)病毒（AAV）載體中，通過單次 AAV 注射即可實現(xiàn)長達(dá) 6 個月的持久基因表達(dá)抑制。
2025 年 5 月 7 日，張鋒團(tuán)隊在Nature Biotechnology期刊發(fā)表了題為：Evolution-guided protein design of IscB for persistent epigenome editing in vivo的研究論文。
該研究通過整合直系同源物篩選、進(jìn)化和結(jié)構(gòu)引導(dǎo)相結(jié)合的蛋白質(zhì)工程方法、RNA 工程以及基于深度學(xué)習(xí)的結(jié)構(gòu)預(yù)測，對 IscB 蛋白及其向?qū)?RNA（ωRNA）進(jìn)行工程化改造，從而生成了NovaIscB。
這一緊湊型基因編輯工具NovaIscB在人類基因組上實現(xiàn)了高達(dá) 40% 的插入/缺失編輯活性（效率相比野生型 OgeuIscB 提升約 100 倍），并且相對于現(xiàn)有的 IscB 具有更高的特異性。該研究進(jìn)一步證明，NovaIscB 可與甲基轉(zhuǎn)移酶融合，從而創(chuàng)建一個可編程的表觀遺傳編輯系統(tǒng)——OMEGAoff，其緊湊程度足以被裝載到單個腺相關(guān)病毒（AAV）載體中，可在體內(nèi)實現(xiàn)持久的基因抑制（持久抑制PCSK9 基因表達(dá)，顯著降低膽固醇水平，效果持續(xù)超過 6 個月）。
更重要的是，該研究提出的結(jié)合進(jìn)化和結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程方法，為優(yōu)化蛋白質(zhì)功能提供了一個新框架，其潛在應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了基因組編輯的范疇。
Cas9 的祖先：IscB 的先天優(yōu)勢與短板
在基因編輯領(lǐng)域，如何將基因編輯器精準(zhǔn)且高效地遞送到體內(nèi)特定的組織/器官，始終是一項重大挑戰(zhàn)。
2021年9月，張鋒團(tuán)隊在Science期刊發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)了一類廣泛的轉(zhuǎn)座子編碼的 RNA 引導(dǎo)核酸酶，并將其命名為OMEGA 系統(tǒng)（包括IscB、IsrB、Tnp8），它們同樣使用一段RNA（ωRNA）來指導(dǎo)切割 DNA 雙鏈。
其中，IscB被認(rèn)為是 Cas9 的祖先，更重要的是，IscB 非常小，大約 300-550 個氨基酸，僅為Cas9 的約 30%，這意味著它們可被開發(fā)為新的小型化基因編輯工具，從而更容易被遞送到細(xì)胞內(nèi)。
但原始的 IscB 存在三大硬傷：
1、有效向?qū)NA 長度僅 13bp，導(dǎo)致特異性較低，易脫靶，與之相比，Cas9 的有效向?qū)NA 長度為 17-20bp；
2、編輯效率不足野生型 Cas9 的 1%；
3、無法適配復(fù)雜的表觀遺傳編輯工具。
進(jìn)化指導(dǎo)的智能改造：四步打造基因魔剪
張鋒團(tuán)隊采用“自然篩選+人工智能”的創(chuàng)新策略，通過四個關(guān)鍵步驟重塑 IscB：
1、自然寶庫篩選
從 144 種 IscB 天然變體中，發(fā)現(xiàn)源自人類腸道微生物的 OrufIscB，其編輯效率比前代提升 5-10 倍。
2、結(jié)構(gòu)嫁接
將 Cas9 的 REC 結(jié)構(gòu)域（負(fù)責(zé)識別和結(jié)合目標(biāo) DNA 序列）精準(zhǔn)移植到 IscB，將有效 引導(dǎo)RNA 長度延長至 20bp，脫靶率降低 3 倍。
3、定向進(jìn)化
通過深度突變掃描，篩選出關(guān)鍵位點E137K/E409R/I533K，使編輯活性再提升 2 倍。
4、RNA工程
精簡向?qū)NA 結(jié)構(gòu)，將其從 225nt 縮短至 166nt，使人類細(xì)胞中的向?qū)NA（ωRNA）表達(dá)量提升4 倍，適配化學(xué)合成遞送。
通過這四個步驟，張鋒團(tuán)隊創(chuàng)造了NovalscB系統(tǒng)：
• 編輯效率達(dá) 40%，媲美傳統(tǒng) Cas9；
• 特異性與 SpCas9 相當(dāng)，遠(yuǎn)超同類小型化基因編輯工具；
• 整個系統(tǒng)尺寸（IscB蛋白 + gRNA）僅 614aa + 166nt，輕松裝入單個 AAV 病毒。
更重要的是，NovalscB系統(tǒng)還可進(jìn)一步用于構(gòu)建堿基編輯器和表觀遺傳編輯器。
體內(nèi)持久編輯：改寫表觀基因編輯的新可能
張鋒團(tuán)隊進(jìn)一步將切割活性喪失的 NovalscB 與甲基轉(zhuǎn)移酶融合，構(gòu)建了表觀遺傳編輯器——OMEGAoff系統(tǒng)。
研究團(tuán)隊使用單個 AAV 載體包裝OMEGAoff 系統(tǒng)，通過靜脈注射遞送，靶向編輯 PCSK9 基因，結(jié)果顯示，從注射后 3 周開始，小鼠血清中 PCSK9 蛋白水平顯著降低，從注射后 4 周開始，小鼠血清中膽固醇水平顯著顯著下降，降低幅度與使用 PCSK9 單抗的臨床效果相當(dāng)，這些效果穩(wěn)定持續(xù)到實驗結(jié)束（6 個月）。為了評估OMEGAoff 系統(tǒng)的毒性，研究團(tuán)隊在實驗結(jié)束時檢測了血清總膽紅素和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，未觀察到顯著變化。這些結(jié)果突顯了使用 OMEGAoff 進(jìn)行持久基因抑制和表觀基因組編輯的潛力。
總的來說，這項研究通過進(jìn)化和結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的蛋白質(zhì)設(shè)計，研究了1000 多種變體，從而創(chuàng)建了NovaIscB以及基于NovaIscB 的表觀遺傳編輯器——OMEGAoff系統(tǒng)，為基因編輯以及表觀遺傳編輯工具箱提供了有前景的新工具。該研究提出的結(jié)合進(jìn)化和結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程方法，為優(yōu)化蛋白質(zhì)功能提供了一個新框架，其潛在應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了基因組編輯的范疇。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-025-02655-3
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