自 CRISPR-Cas9 基因組編輯技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，人們?yōu)橥卣蛊鋺?yīng)用范圍付出了大量努力，從而開(kāi)發(fā)出了堿基編輯器（Base editor，BE）和先導(dǎo)編輯器（Prime editor，PE）。
堿基編輯器能夠轉(zhuǎn)換單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基，而先導(dǎo)編輯器能夠引入堿基替換以及小的片段插入和缺失。由于其靈活性和精準(zhǔn)性，先導(dǎo)編輯器在包括細(xì)胞和基因治療以及疾病建模在內(nèi)的治療應(yīng)用方面正受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，先導(dǎo)編輯器受限于其較低的編輯效率，因此，人們探索了各種策略以提高先導(dǎo)編輯效率。
2025 年 8 月 5 日，首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Cell 上發(fā)表了題為：AI-generated MLH1 small binder improves prime editing efficiency 的研究論文。
該研究利用 David Baker 團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的 AI 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)工具--RFdiffusion，設(shè)計(jì)了靶向抑制錯(cuò)配修復(fù)（MMR）通路的 MLH1 小型結(jié)合蛋白（MLH1-SB），并使用 AlphaFold3 從設(shè)計(jì)的候選蛋白中高效篩選最佳蛋白--一個(gè)僅由 82 個(gè)氨基酸組成的 MLH1-SB，其可與當(dāng)前的各種先導(dǎo)編輯器兼容適配，在人類(lèi)細(xì)胞和小鼠體內(nèi)大幅提高先導(dǎo)編輯效率。
這項(xiàng)研究凸顯了生成式人工智能（generative AI）在推進(jìn)基因組編輯技術(shù)方面的巨大潛力。
PE2 是一種優(yōu)化的 PE 架構(gòu)，由融合了逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的 Cas9 切口酶（nCas9）組成，可在目標(biāo)位點(diǎn)合成包含所需編輯的 DNA 鏈。此過(guò)程依賴(lài)于作為逆轉(zhuǎn)錄模板的先導(dǎo)編輯向?qū)?RNA（pegRNA）的 3' 端延伸。為了提高 PE 的效率，PE3 和 PE5 采用了一種額外的切口向?qū)?RNA（ngRNA），在未編輯的鏈上制造第二個(gè)切口，使懸突平衡（flap equilibrium）向期望的編輯方向偏移。
進(jìn)一步的研究表明，細(xì)胞中固有的錯(cuò)配修復(fù)（MMR）途徑會(huì)阻礙在目標(biāo)位點(diǎn)上所需編輯的整合。在錯(cuò)配修復(fù)中，MutS 同源物（MutSα 由 MSH2-MSH6 組成，MutSβ 由 MSH2-MSH3 組成）識(shí)別錯(cuò)配，并招募 MutLα 復(fù)合物（由 MLH1 和 PMS2 組成）以促進(jìn)修復(fù)。
因此，抑制關(guān)鍵的錯(cuò)配修復(fù)組分（例如 MSH2、MSH3、MSH6、MLH1 和 PMS2）可顯著提高 PE 效率。基于這一點(diǎn)，PE4 通過(guò)同時(shí)遞送 MLH1dn 蛋白（用于移植 MutLα 復(fù)合物）和先導(dǎo)編輯器，以提高 PE 效率。然而，近期的研究顯示，只有對(duì)大約 10 bp 或更小片段的編輯時(shí)，抑制 MMR 途徑才能提高 PE 效率。
為了進(jìn)一步提高 PE 效率，在 pegRNA 的 3' 末端引入了 RNA 假結(jié)結(jié)構(gòu)基序，以增強(qiáng)其穩(wěn)定性并防止 3' 末端延伸部分的降解。此外，利用噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化技術(shù)（PACE）進(jìn)行蛋白質(zhì)進(jìn)化，已開(kāi)發(fā)出多種 PE6 架構(gòu)，其編輯效率得到了提高。
此外，還有研究使用小 RNA 結(jié)合外切核酸酶保護(hù)因子 La 來(lái)保護(hù) pegRNA 的 3' 端，從而開(kāi)發(fā)了效率更高的 PE7。
盡管上述研究在提高先導(dǎo)編效率術(shù)方面取得了許多進(jìn)步，但其編輯效率仍不盡如人意，尤其是在治療應(yīng)用方面。此外，重要的是要在不使用切口向?qū)?RNA（ngRNA）的情況下改進(jìn)先導(dǎo)編輯結(jié)構(gòu)，因?yàn)?ngRNA 可能會(huì)引入意外的插入/缺失突變。
近年來(lái)，人工智能（AI）技術(shù)的進(jìn)步使得基于序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計(jì)成為可能。而且，AI 技術(shù)已被應(yīng)用于開(kāi)發(fā)基于 CRISPR 基因編輯工具。
但 AI 驅(qū)動(dòng)的 CRISPR 基因組編輯改進(jìn)，主要集中在提高關(guān)鍵酶（例如核酸酶 Cas9 和 脫氨酶 TadA）的催化活性上。此外，諾獎(jiǎng)得主、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)先驅(qū) David Baker 開(kāi)發(fā)的 用于設(shè)計(jì)結(jié)合蛋白的 AI 工具--RFdiffusion，很大程度上僅限于設(shè)計(jì)單結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合蛋白以及抗體。
在這項(xiàng)最新研究中，研究團(tuán)隊(duì)利用 RFdiffusion 來(lái)抑制錯(cuò)配修復(fù)（MMR）通路，從而提高先導(dǎo)編輯（PE）效率。
這是通過(guò)兩步策略實(shí)現(xiàn)的：1）從頭設(shè)計(jì)具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的全新蛋白質(zhì)，包括一個(gè)非競(jìng)爭(zhēng)性錨定位點(diǎn)、一個(gè)靶向關(guān)鍵活性的抑制位點(diǎn)以及一個(gè)單純的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位點(diǎn)；2）采用基于 AlphaFold3 的篩選系統(tǒng)來(lái)挑選最佳候選蛋白質(zhì)。
通過(guò)這種方法，研究團(tuán)隊(duì)利用 RFdiffusion 生成了一系列 MLH1 的小型結(jié)合蛋白--MLH1-SB，顯著提高了 PE 效率，并且與現(xiàn)有的 PE 架構(gòu)兼容，包括 PE2、PEmax、PE6 和 PE7。
在這些生成的 MLH1-SB 中，研究團(tuán)隊(duì)從中確定了一個(gè)僅由 82 個(gè)氨基酸組成的最優(yōu) MLH1-SB，其緊湊的結(jié)構(gòu)使其能夠無(wú)縫整合到現(xiàn)有的 PE 架構(gòu)（PEmax、PE6 和 PE7）中，從而開(kāi)發(fā)出諸如 PEmax-SB、PE6-SB 和 PE7-SB 這樣的 PE-SB 平臺(tái)。相比之下，MLH1dn 蛋白的多達(dá) 753 個(gè)氨基酸，體積龐大，難以整合和遞送。
值得注意的是，PE7-SB2 系統(tǒng)通過(guò)融合了兩個(gè) MLH1-SB，在人類(lèi)細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著提高的 PE 效率，分別比 PEmax 和 PE7 提高了約 18.8 倍和 2.5 倍。此外，體內(nèi)研究顯示，在小鼠體內(nèi)，PE7-SB2 的 PE 效率相比 PE7 提高了約 3.4 倍。
鑒于腺相關(guān)病毒（AAV）和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等體內(nèi)基因治療遞送方法的有效載荷能力，該研究中通過(guò) AI 從頭設(shè)計(jì)并生成的 MLH1-SB 能夠在保持最小尺寸的同時(shí)顯著增強(qiáng) PE 效率，預(yù)計(jì)將促進(jìn)高效的體內(nèi)基因編輯療法的開(kāi)發(fā)。
該研究的亮點(diǎn)：
RFdiffusion 生成的 MLH1 小型結(jié)合蛋白（MLH1-SB）抑制錯(cuò)配修復(fù)活性；
AlphaFold 3 識(shí)別出有效的 MLH1 小型結(jié)合蛋白；
MLH1 小型結(jié)合蛋白可提高先導(dǎo)編輯效率且毒性有限；
MLH1 小型結(jié)合蛋白的緊湊尺寸使其能夠集成到先導(dǎo)編輯架構(gòu)中。
最后，研究團(tuán)隊(duì)表示，生成式人工智能（generative AI）工具的快速發(fā)展正在改變學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的研究格局。該研究中使用了便捷的網(wǎng)頁(yè)版 RFdiffusion，僅用 3 天時(shí)間就快速生成了 MLH1-SB，而且無(wú)需本地高算力支持，此外，使用 AlphaFold3 高效篩選蛋白，只用了 1 天時(shí)間，整個(gè)過(guò)程僅花費(fèi) 4 天時(shí)間。這種高成功率、高效率，大大縮短了后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間和成本。
論文鏈接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00799-8
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